Técnicas de desinfección y esterilización de materiales y medios de cultivo.

Práctica No. 3

Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cambios de condiciones ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de hábitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo físico químico. Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y esterilización para limitar su presencia o eliminarlos. La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo de organismo y que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras que la desinfección es un proceso que solamente elimina formas vegetativas de los microorganismos.

La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos de mayor utilización en Microbiología. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por oxidación, por ejemplo al ponerlos directamente ala flama de un mechero o en horno a 1540-180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican principalmente en la esterilización de asas de inoculación y todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.

Los proceso con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones, y cultivos bacterianos que se desechan, el más recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presión para alcanzar temperaturas de 121°C. El material se deja a esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destrucción de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor.

Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor como las soluciones de vitaminas, aminoácidos, etc. Se esterilizan por filtración en membranas estériles de 0.2 micras de diámetro y para el caso de materiales plásticos es recomendable el uso de gases como óxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies generalmente se desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos químicos en forma líquida como: los fenoles, compuestos cuaternarios de amonio (alquildimetil bencilamonio), formaldehído, alcoholes, halógenos y detergentes.

Es importante mantener la asepsia en el laboratorio, y protegerse al maximo, con cubrebocas, bata, gorro, lentes, guantes, para evitar lo mas que se pueda el contacto con las bacterias.

Como sabemos el horno es un equipo muy usado para la esterilizacion de los materiales usados en microbiologia.

La caja de petri es uno de los materiales mas usados en el laboratorio de microbiologia y mas específicamente en los medios de cultivos, junto a los tubos de ensaye.

• Preparación del material de vidrio y medios de cultivo

1. Lavar perfectamente las cajas de Petri y pipetas con escobillón y

detergente. Enjuagar con abundante agua corriente.

2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con

una pipeta, por las paredes interiores. Dejar escurrir el material sobre una

toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningún otro

medio.

3. Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de Petri y

pipetas con papel de estraza. Para los tubos y matraces se elaborarán

tapones de algodón y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los

que finalmente se les colocará un capuchón de papel.

4. Preparar 120 mL de Agar Nutritivo (AN), calentar la mezcla en una parrilla

con agitación constante hasta ebullición, durante 1 minuto ( cuidar que no

se proyecte), el medio se esteriliza en el autoclave.

5. Preparar 120 mL de medio de cultivo Papa dextrosa agar ( PDA) en un

matraz Erlenmeyer de 250 mL, ajustar el pH del medio a 501-5.6. colocar

un magneto de agitación y calentar hasta ebullición durante 1 minuto;

cuidando de que no se proyecte o derrame. el medio se esteriliza en el

autoclave.6. 

• Esterilización de materiales y medios de cultivo

1. Las cajas de Petri y pipetas envueltas se colocarán en horno a 150°C

durante 2 horas. Después de sacarlas, dejarlas enfriar y abrir los paquetes

únicamente en área aséptica. O esterilizarlas en el autoclave.

2. Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo a las

siguientes instrucciones:

a. Revisar que el nivel de agua coincida con la marca en el tubo indicador. En

caso necesario añadir agua destilada.

b. Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto.

Acomodar los medios y materiales en la canasta del autoclave y colocarla

dentro.

c. Cerrar la puerta, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada

y esperar a que salga el vapor de agua por el orificio de purgado. Después

cerrar este orificio con la válvula de seguridad.

d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121°C o 15 lbs de

presión revisando continuamente la escala del manómetro. Una vez

alcanzada esta temperatura deberá bajarse el nivel de calentamiento

moviendo la perilla de control al nivel medio o bajo.

e. Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos.

f. Apagar la autoclave y dejar que baje la presión al valor de “0”. Quitar la

válvula de seguridad y con la ayuda de guante de abesto o una jerga

húmeda abrir cuidadosamente la puerta, de adelante hacia atrás para evitar

quemaduras por la salida del vapor.

• Preparación de las cajas de Petri con medios de cultivo

1. Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado de

la autoclave se enfríen a una temperatura aproximada de 40-50 °C,

que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de

la mana sin sentir un calor excesivo.

2. Cerca del mechero etiquetar 3 cajas con AN, 3 con PDA y 3 con MM

o EMB. Los medios de cultivo se vacían en las cajas de Petri

(aproximadamente 25-30 mL) en zona aséptica cerca del mechero o

en campana de flujo laminar.

3. Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 minutos) y

posteriormente envolver las cajas cuidadosamente con papel estraza

o acomodarlas en forma invertida en bolsas de plástico limpias.

4. Guardarlas en refrigeración hasta 24 horas antes de utilizarlas.

• Prueba de esterilidad de materiales

1. Colocar las cajas de Petri en forma invertida en una estufa de incubación

ajustada a 30°C durante 24-48 horas.

2. Revisar los tubos y cajas de Petri para detectar la presencia de

contaminantes, así como la formación de colonias microbianas en la

superficie de medios sólidos.

3. Si no hay contaminación de los medios, se abrirá una de las cajas de Petri

de cada medio durante 1 minuto en el laboratorio o zonas accesorias al

mismo y se etiquetará como “al aire”.

4. La otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca

del mechero y se etiquetará “en área aséptica”.

5. La tercer caja se conservará sin abrir y se etiqueta como “control”.