FIN DE SEMESTRE......

Al concluir el semestre nos llevamos muchas sorpresas y un aprendizaje nuevo, ya que las cosas que aprendimos, los conocimientos que adquirimos fueron bastantes y nutritivos, le damos las gracias a nuestra profesora por estar siempre con nosotros y en cada paso siempre estuvo allí, asimismo a mi equipo de trabajo que juntos sacábamos el trabajo día a día. solo esperamos que para el próximo semestre podamos seguir todos juntos y seguir adquiriendo mas conocimiento. GRACIAS..

Preparación de medios de cultivo sólidos y líquidos

Práctica No.4

Preparación de medios de cultivo sólidos y líquidos

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial, éste debe reunir una serie de condiciones tales como: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

Clasificación de medios de cultivo:

• Según su estado físico:

Líquidos

Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes disueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado número de microorganismos. Ejemplo. Caldo nutritivo.

Sólidos

Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les añaden agentes solidificante como agar, gelatina o sílica gel. Se utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los microorganismos en el laboratorio. Ejemplo. Agar nutritivo.

El gelificante más usado es el agar-agar, extraído de las algas rojas (ej.: Gelidium), del cual existen versiones más o menos purificadas. Las más puras que se enriquecen con el polisacárido agarosa para evitar la introducción de sustancias “contaminantes” inadvertidas que falseen las interpretaciones sobre el comportamiento nutricional del microorganismo; son las que se emplean para los medios definidos (Ver más abajo). El agar presenta la gran ventaja de que una vez gelificado, no funde hasta cerca de los 100 °C, lo que permite su uso para la inmensa mayoría de los microorganismos, que son mesófilos.

• Según la naturaleza de sus constituyentes:

Medios naturales, complejos o indefinidos

Están constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal y usualmente se complementan con el añadido de minerales y otras sustancias. No se conocen todos los componentes del medio de cultivo, ni las cantidades exactas en que están presentes. Este tipo de medio es el ideal para cuando simplemente se pretende obtener un buen crecimiento microbiológico, ya que su confección es fácil y rápida (Basta pesar una cierta cantidad del extracto desecado, suministrado por casas comerciales, disolverlo en agua y esterilizar en autoclave). Ej. Extracto de carne, extracto de levaduras.

Medios sintéticos

Se preparan a partir de ingredientes químicamente puros y por lo tanto se puede conocer exactamente su composición cuali y cuantitativa. Por su costo sólo se emplean en procedimientos especiales.

Medios “mezcla” de los anteriores

Denominado medio semisintético, llevan algunas sustancias químicas cuya naturaleza y cantidad se conoce, junto con sustancias de naturaleza y composición indefinida.

• Según sus propósitos de uso:

Medios de enriquecimiento

Se llama enriquecimiento a cualquier cultivo en medio líquido que resulte en un incremento en el número de un tipo dado de microorganismo en relación con el número de otros tipos de microorganismos que puedan estar en el inóculo. Un medio de enriquecimiento puede contener sustancias que favorezcan el crecimiento del microorganismo que nos interesa o que inhiban el crecimiento de los otros tipos de microorganismos presentes. La selectividad de un cultivo de enriquecimiento no está determinada únicamente por la composición química del medio usado, sino que en un medio dado puede ser variada significativamente modificando otros factores tales como: temperatura, pH, fuerza iónica, iluminación, aireación, etc. Ej. Caldo tetrationato utilizado para el enriquecimiento de las especies del género Salmonella provenientes de muestras de heces, orina, agua o alimentos.

Medios selectivos

Son básicamente iguales a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. Ej. Agar desoxicolato citrato utilizado para el aislamiento de patógenos entéricos.

Medios diferenciales

No contienen sustancias inhibidoras, es decir, permiten el crecimiento de muchos tipos de microorganismos, pero sí contienen indicadores de productos derivados de la actividad metabólica de los microorganismos sobre algunos de los componentes del medio. Se utilizan para la identificación de los microorganismos. Ej.: Agar base rojo fenol utilizado para detectar fermentación de carbohidratos.

Medios selectivos diferenciales

A veces se combinan en un mismo medio las características de ser selectivo y diferencial. Por ejemplo, el agar Mac Conkey, este medio contiene sales biliares y cristal violeta, que inhiben el crecimiento de las bacterias gram positivas. Pero como también contiene lactosa y un indicador de pH permite distinguir entre las bacterias fermentadoras de lactosa y las que no lo son.

Ejemplos de medios de cultivo:

·         Agar nutritivo: Este medio es bastante bueno para el cultivo de gérmenes que no presentan exigencias particulares. No es diferencial.

·         Agar sangre: Es un medio enriquecido que se utiliza además para la investigación de los diversos tipos de hemólisis (α, ß ó gamma ). Se utiliza para el crecimiento de estreptococos. Para la preparación del agar sangre se puede utilizar el agar nutritivo enriquecido con cloruro sódico o un preparado enriquecido con otras sustancias como Columbia o el tripticase de soja. La adición de sangre a un medio de cultivo no proporciona las sustancias que están en el interior de los hematíes, pero sí puede añadir factores inhibidores del crecimiento bacteriano presentes en el suero. Este es un inconveniente que puede solucionarse calentando la sangre para romper los eritrocitos y para que se destruyan las sustancias inhibidoras, que son termolábiles.La sangre utilizada como aditivo a estos medios suele ser sangre de carnero diluida al 5%, pero en algunas ocasiones es necesario utilizar sangre de otras especies (caballo, conejo, humana), pues facilitan las reacciones hemolíticas o contienen determinados factores de enriquecimiento o no poseen sustancias inhibidoras del crecimiento de determinados gérmenes. Agar chocolate: El agar chocolate se obtiene calentando la sangre antes de adicionarla a la media base. Por esta razón el agar chocolate contiene hemoglobina, que aporta al medio un importante elemento para el crecimiento: el factor X o hemina termoestable. El agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de Neisserias (gonococos ymeningococos) y Haemophilus, pero en él pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes. El agar chocolate puede convertirse quizás en uno de los medios más enriquecidos si añadimos una mezcla de factores de crecimiento no contenidas en la sangre. Estas mezclas, denominadas de forma diferente según las casas comerciales (Polivitex, Isovitalex, etc.) contienen más de una docena de compuestos que confieren a este medio unas cualidades nutritivas extraordinarias. Por adición de uno o varios antibióticos pueden lograrse medios inhibidores o selectivos para el crecimiento de determinados microorganismos.

·         Agar C.L.E.D.: El medio C.L.E.D. (Cistina Lactosa Electrólito Deficiente) está recomendado para el recuento e identificación presuntiva de los microorganismos de las vías urinarias. Su bajo contenido en electrolitos evita la invasión de los cultivos por Proteus.La presencia de lactosa en su composición le confiere el carácter de medio diferencial, aunque la interpretación sea diferente al anterior medio por la incorporación de otro indicador: el azul de bromotimol. Las colonias lactosa positivas aparecerán de color amarillo y las lactosa negativas lo harán con un color verdoso, blanco o azulado.

·         Agar S.S.:El agar SS es un medio selectivo empleado para el aislamiento de Salmonella y Shigella a partir demuestras fecales. El medio contiene sales biliares y verde brillante para impedir el crecimiento de coliformes y gérmenes Gram positivos. La presencia de lactosa y rojo de metilo nos permiten diferenciar las colonias que fermentan la lactosa (rosas o rojas) de las que no lo hacen (incoloras).Las especies de Salmonella y Shigella no fermentan nunca la lactosa por lo que este medio es excelente para descartar todas las colonias que no cumplan este requisito. El agar SS es doblemente diferencial, porque además de indicarnos el comportamiento de los gérmenes con relación a la lactosa, nos muestra los gérmenes que son capaces de producir ácido sulfhídrico, que se manifiesta como un precipitado de color negro en el centro de la colonia.

·         Agar Mueller-Hinton: Es el medio universalmente aceptado para la realización de los antibiogramas o pruebas de sensibilidada los antimicrobianos. A él nos referiremos más ampliamente en el capítulo correspondiente.

·         Agar Tripticase de soja: Es un medio utilizado para el crecimiento de gérmenes exigentes, como Brucella, Neisseria o Streptococcus. Es un medio muy enriquecido, pero no es diferencial. Caldo tioglicolato con resazurina: Es un medio recomendado para controles de esterilidad. Permite el cultivo de aerobios, anaerobiosy microaerófilos.

·         Agar Chapman: Es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos. Su elevado contenido en cloruro sódico permite la inhibición de la mayoría de los otros gérmenes. La presencia de manitol y rojo fenol convierten a este medio en diferencial: así se puede identificar presuntivamente el Staphylococcus aureus, ya que estegérmen crece bien en medios salados y fermenta el manitol (colonias amarillas).

·         Agar Baird-Parker: Permite el crecimiento de estafilococos coagulasa positivos, a la vez que los diferencia del resto.

·         Medio de Loeffler: Es un medio específico para el cultivo de Corynebacterium difteriae.

·         Agar Kligler: Medio específico para pruebas de identificación de enterobacterias. Aunque de él hablaremos conmás detenimiento en el capítulo de pruebas de identificación bacteriana, podemos ir adelantando que se tratade un medio diferencial que permite conocer el comportamiento del microorganismo ante dos azúcares (glucosa y lactosa), investigar la formación de gas y comprobar si el microorganismo puede producir sulfatoferroso a partir del tiosulfato sódico.

·         Agar Levine ó EMB (Eosina azul de metileno):Se utiliza para aislamiento de enterobacterias, pues impide el crecimiento de Gram positivos y diferencia muy bien a E. coli, cuyas colonias adquieren un color negruzco con un brillo metálico característico. Caldo selenito-F: Se utiliza exclusivamente para enriquecimiento de Salmonellas.

·         Agar Schaedler: Es un medio con sangre y vitamina K muy adaptado para el cultivo de anaerobios.

·         Agar Gardnerella:Agar con sangre humana más una mezcla de antibióticos que permiten la observación de colonias betahemolíticas características de Gardnerella vaginalis

Técnicas de desinfección y esterilización de materiales y medios de cultivo.

Práctica No. 3

Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cambios de condiciones ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de hábitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo físico químico. Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y esterilización para limitar su presencia o eliminarlos. La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo de organismo y que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras que la desinfección es un proceso que solamente elimina formas vegetativas de los microorganismos.

La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos de mayor utilización en Microbiología. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por oxidación, por ejemplo al ponerlos directamente ala flama de un mechero o en horno a 1540-180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican principalmente en la esterilización de asas de inoculación y todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.

Los proceso con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones, y cultivos bacterianos que se desechan, el más recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presión para alcanzar temperaturas de 121°C. El material se deja a esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destrucción de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor.

Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor como las soluciones de vitaminas, aminoácidos, etc. Se esterilizan por filtración en membranas estériles de 0.2 micras de diámetro y para el caso de materiales plásticos es recomendable el uso de gases como óxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies generalmente se desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos químicos en forma líquida como: los fenoles, compuestos cuaternarios de amonio (alquildimetil bencilamonio), formaldehído, alcoholes, halógenos y detergentes.

Es importante mantener la asepsia en el laboratorio, y protegerse al maximo, con cubrebocas, bata, gorro, lentes, guantes, para evitar lo mas que se pueda el contacto con las bacterias.

Como sabemos el horno es un equipo muy usado para la esterilizacion de los materiales usados en microbiologia.

La caja de petri es uno de los materiales mas usados en el laboratorio de microbiologia y mas específicamente en los medios de cultivos, junto a los tubos de ensaye.

• Preparación del material de vidrio y medios de cultivo

1. Lavar perfectamente las cajas de Petri y pipetas con escobillón y

detergente. Enjuagar con abundante agua corriente.

2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con

una pipeta, por las paredes interiores. Dejar escurrir el material sobre una

toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningún otro

medio.

3. Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de Petri y

pipetas con papel de estraza. Para los tubos y matraces se elaborarán

tapones de algodón y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los

que finalmente se les colocará un capuchón de papel.

4. Preparar 120 mL de Agar Nutritivo (AN), calentar la mezcla en una parrilla

con agitación constante hasta ebullición, durante 1 minuto ( cuidar que no

se proyecte), el medio se esteriliza en el autoclave.

5. Preparar 120 mL de medio de cultivo Papa dextrosa agar ( PDA) en un

matraz Erlenmeyer de 250 mL, ajustar el pH del medio a 501-5.6. colocar

un magneto de agitación y calentar hasta ebullición durante 1 minuto;

cuidando de que no se proyecte o derrame. el medio se esteriliza en el

autoclave.6. 

• Esterilización de materiales y medios de cultivo

1. Las cajas de Petri y pipetas envueltas se colocarán en horno a 150°C

durante 2 horas. Después de sacarlas, dejarlas enfriar y abrir los paquetes

únicamente en área aséptica. O esterilizarlas en el autoclave.

2. Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo a las

siguientes instrucciones:

a. Revisar que el nivel de agua coincida con la marca en el tubo indicador. En

caso necesario añadir agua destilada.

b. Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto.

Acomodar los medios y materiales en la canasta del autoclave y colocarla

dentro.

c. Cerrar la puerta, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada

y esperar a que salga el vapor de agua por el orificio de purgado. Después

cerrar este orificio con la válvula de seguridad.

d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121°C o 15 lbs de

presión revisando continuamente la escala del manómetro. Una vez

alcanzada esta temperatura deberá bajarse el nivel de calentamiento

moviendo la perilla de control al nivel medio o bajo.

e. Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos.

f. Apagar la autoclave y dejar que baje la presión al valor de “0”. Quitar la

válvula de seguridad y con la ayuda de guante de abesto o una jerga

húmeda abrir cuidadosamente la puerta, de adelante hacia atrás para evitar

quemaduras por la salida del vapor.

• Preparación de las cajas de Petri con medios de cultivo

1. Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado de

la autoclave se enfríen a una temperatura aproximada de 40-50 °C,

que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de

la mana sin sentir un calor excesivo.

2. Cerca del mechero etiquetar 3 cajas con AN, 3 con PDA y 3 con MM

o EMB. Los medios de cultivo se vacían en las cajas de Petri

(aproximadamente 25-30 mL) en zona aséptica cerca del mechero o

en campana de flujo laminar.

3. Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 minutos) y

posteriormente envolver las cajas cuidadosamente con papel estraza

o acomodarlas en forma invertida en bolsas de plástico limpias.

4. Guardarlas en refrigeración hasta 24 horas antes de utilizarlas.

• Prueba de esterilidad de materiales

1. Colocar las cajas de Petri en forma invertida en una estufa de incubación

ajustada a 30°C durante 24-48 horas.

2. Revisar los tubos y cajas de Petri para detectar la presencia de

contaminantes, así como la formación de colonias microbianas en la

superficie de medios sólidos.

3. Si no hay contaminación de los medios, se abrirá una de las cajas de Petri

de cada medio durante 1 minuto en el laboratorio o zonas accesorias al

mismo y se etiquetará como “al aire”.

4. La otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca

del mechero y se etiquetará “en área aséptica”.

5. La tercer caja se conservará sin abrir y se etiqueta como “control”.