Práctica No.2

Colorantes, mordientes  e indicadores

Los colorantes utilizados en Microbiología son compuestos orgánicos que contienen grupos cromóforos y auxocromos unidos a anillos aromáticos.
La presencia de grupos cromóforos en una molécula (grupos azo, nitro, etc.) no es suficiente para que ésta actúe como colorante, esto es que se fije a las estructuras a colorear. Para ser colorante debe poseer grupos que sean capaces de disociarse llamados auxocromos. Por ejemplo el 1, 3,5 trinitrobenceno, es un compuesto coloreado pero no es un colorante. Sin embargo, si se remplaza un H por un OH en el anillo bencénico, se obtiene el ácido pícrico que también es coloreado pero al poseer un grupo disociable (auxocromo) actúa como colorante.
La distinción entre colorantes ácidos y básicos depende de la carga de la parte de la molécula responsable del color. Si es negativa se trata de un colorante ácido y si es positiva se trata de un colorante básico. Esta diferencia es importante debido a que, según sean ácidos o básicos, los colorantes tendrán afinidad por diferentes zonas de la anatomía celular.

Algunos colorantes utilizados comúnmente en Microbiología son fucsina básica, cristal violeta, safranina, azul de metileno, etc.

• Los pasos fundamentales previos a una coloración son: extendido, secado y fijado. 

a) Extendido: se coloca una pequeña porción de la muestra en un portaobjetos y se extiende con el ansa en forma de óvalo. Para muestras provenientes de medios sólidos, debe colocarse previamente una gota de agua sobre el portaobjetos.

b) Secado: puede dejarse secar el extendido a temperatura ambiente, o colocar a 30-40 cm sobre la llama del mechero.

c) Fijado: la fijación tiene como finalidades evitar el desprendimiento del preparado durante la coloración así como también preservar la forma original de los microorganismos.


El procedimiento más común es pasar el preparado 3 veces por la llama del mechero. Sin embargo, esta técnica no es conveniente para ciertas coloraciones para las cuales deben utilizarse procedimientos más suaves. Algunos agentes fijadores utilizados son etanol, metanol, formol, sales de mercurio, tetróxido de osmio, ácido pícrico, etc. Debe tenerse en cuenta que, luego del procedimiento de coloración, los preparados pueden contener microorganismos viables, en especial si hay esporas. Por consiguiente siempre deben considerarse como potencialmente riesgosos y manejarse con precaución.
La fenolftaleína es un compuesto químico orgánico que se obtiene por reacción del fenol (C6H5OH) y el anhídrido ftálico (C8H4O3), en presencia de ácido sulfúrico.
En farmacología y terapéutica se utiliza como laxante catar. En México y otros países, a pesar de que se ha limitado su uso como medicamento dada la suposición de que tiene efectos cancerígenos, fue incorporado a la farmacopea homeopática y se sigue vendiendo en las farmacias como especialidad homeopática.
En análisis clínicos, la fenolftaleína se utiliza como agente de diagnóstico para investigar la función renal y en la determinación de orina residual en la vejiga. Aquí se usa una forma inyectable del fármaco. Igualmente en microbiología este compuesto químico presente en la forma de difosfato de fenolftaleína es utilizado como componente para la identificación de bacterias específicas (fosfatasa ácida positivas) en algunos medios de cultivos selectivos.

• Preparación de tinción de Gram.

•        Colorante Cristal violeta

• Tetrametilo (cuatro metilos) es conocido como Violeta de metilo 2B, y encuentra usos específicos en química y medicina.

• Pentametilo (cinco metilos) es conocido como Violeta de metilo 6B, y es más oscuro como colorante que 2B.

• Hexametilo (seis metilos) es conocido como Violeta de metilo 10B, o específicamente violeta cristal. Es mucho más oscura que la 2B, y aún más oscura que la 6Bk

•        Violeta de Genciana 

El violeta de metilo, comúnmente denominado cristal violeta o violeta de genciana, es el nombre dado a un grupo de compuestos químicos empleados como indicadores de pH y colorantes.

•              Solución Lugol

•            Solución alcohol –cetona   

•               Colorante Safranina

La safranina (también llamada Safranina O o rojo básico 2), es un colorante biológico, de contraste que se utiliza en la Tinción de Gram para proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias Gram+ y tiñe de rosa a las bacterias G- ; en histología y en citología. La safranina se usa como líquido de contraste en algunos protocolos de tinción, coloreando el núcleo celular de rojo. También para detectar cartílago, mucina y gránulos de mastocitos.

•                Preparación de la fenolftaleína .

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en Bacteriología para la visualización debacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color morado, y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella

El violeta de metilo, comúnmente denominado cristal violeta o violeta de genciana, es el nombre dado a un grupo de compuestos químicos empleados como indicadores de pH y colorantes.

Los violetas de metilo son mezclas de: N-tetra, N-penta y N-hexametil p-rosanilinas. Por la mezcla de diferentes versiones, el fabricante puede crear diferentes tonos de violeta en el colorante final. Cuanto más metilado esté el colorante, su color será de un violeta más oscuro:

El lugol o disolución de Lugol es una disolución de yodo molecular I2 y yoduro potásico KI en agua destilada. Se preparó por primera vez en 1829 y recibe su nombre en honor al médico francés J.G.A. Lugol

Este producto se emplea frecuentemente como desinfectante y antiséptico, para la desinfección de agua en emergencias y como un reactivo para la prueba del yodo en análisis médicos y de laboratorio.

También se ha usado para cubrir deficiencias de yodo; sin embargo, se prefiere el uso de yoduro potásico puro debido a la ausencia de yodo diatómico, forma molecular cuyo consumo puede resultar tóxico.

Medir  Un volumen de Acetona  por dos volúmenes de Etanol de 95° y guardar en un frasco color mbar y etiquetar.

La fenolftaleína de fórmula (C₂₀H₁₄O₄) es un indicador de pH que en disoluciones ácidas permanece incoloro, pero en presencia de bases toma un color rosado con un punto de viraje entre pH=8,0 (incoloro) a pH=9,8 (magenta o rosado).

Es un compuesto químico orgánico que se obtiene por reacción del fenol (C₆H₅OH) y el anhídrido ftálico (C₈H₄O₃) en presencia deácido sulfúrico.